出国体检查乙肝携带者吗
如果把一滴油,滴到水里,会看到怎样的景象?
油会平铺在水面上,自动形成一个个或大或小的圆形油滴。
这个现象,你可能已经见怪不怪了。
但你听说过牛顿被苹果砸发现万有引力的励志故事吧,那么你观察到油在水面自动形成圆形油滴,能发现什么呢?水面的油为何不是形成三角形、正方形、正六边形呢?
学过物理的你,应该能回答:油不溶于水且轻于水,浮在水面的油,因为表面张力而收缩。在油滴体积不变的情况下,收缩成圆形/球形,是表面积最小的,所以我们看到了自动呈现圆形/球形的油滴。
言归疫苗。
有一类疫苗,业界称其为病毒样颗粒(VLP,Virus-Like Particle)疫苗,顾名思义就是看上去长得就像病毒的疫苗,只是其内部没有主宰病毒生命的核酸,所以不会感染人。
VLP疫苗,与前面说的水面的油自动形成圆球形有关系么?
有。
实际上,构成VLP疫苗的材料是能刺激人体产生免疫力的特定病毒蛋白(抗原蛋白),不同病毒的抗原蛋白不同,但诡异的是: 在液体中,这些抗原蛋白几乎都能自动聚集成正二十面体的球形!长得很像病毒!
典型的病毒颗粒就是 正二十面体 ,眼熟么?
很像病毒的VLP疫苗,有什么技术优势?
疫苗要取得良好的保护效果,尽量模拟病原微生物是一个很好的技术路线。人体如果能像识别病原微生物那样识别疫苗,那么这款疫苗成功的可能性就很大。
具体来说,VLP疫苗具有和天然病毒颗粒类似的空间立体结构和成分,能够通过类似病毒感染的途径刺激人体免疫系统,高效诱导人体产生免疫保护反应。
而且,VLP疫苗还具有佐剂效应,类似于打游戏自带外挂,效果更上一层楼。
VLP疫苗看上去很优秀,以前怎么没听说过?
其实不然,VLP疫苗就在我们身边,乙肝疫苗、戊肝疫苗、宫颈癌疫苗都是现役经典的VLP疫苗,另外还有基于VLP技术很多疫苗在研发中。
疫苗针对的病原体,主要可以分为细菌类疫苗和病毒类疫苗。VLP疫苗既然是病毒样颗粒疫苗,那么就和细菌类疫苗无关,而是病毒类疫苗的一种技术路线。
VLP技术平时很少被说起,因为它实际上是蛋白疫苗的一种立体结构,蛋白疫苗(多数是基因工程重组蛋白)才是我们耳熟能详的一种主流技术路线。
如果把一个个蛋白比喻为一粒粒沙子,那么沙子可以是一盘散沙,也可以是一个个沙堡。
蛋白疫苗之于VLP疫苗=沙子之于沙堡
沙堡是沙子做的,但沙堡和沙子,并不是一回事。
一堆沙子不可能自动形成一个沙堡,然而若干个蛋白聚在一起,无需科学家去干预,竟然可以自动形成正二十面体的病毒样颗粒,这就是VLP疫苗的神奇之处。
究其根本原因,还要从像解释水面的圆形油滴那样,从物理学/数学上寻求答案,可能的机制我猜是:
同等质量或体积,球体的表面积最小。正多面体最多只有正二十面体,而正二十面体是最接近于球形的几何结构,在表面张力的作用下,多个病毒蛋白如果要自动搭建出某种立体结构,那么正二十面体就是最佳选择。
神奇的正二十面体
VLP疫苗在疫苗界的江湖地位如何?
可以说,VLP疫苗是疫苗技术分类的一个小分支,曾经没有存在感,但最近有点热门。
主流的病毒类疫苗技术路线分类主要是:活疫苗、灭活疫苗和蛋白疫苗。另外,从埃博拉疫苗和COVID-19疫苗开始,病毒载体疫苗和mRNA疫苗也登上了历史舞台。
活疫苗,含有真正的活病毒颗粒。灭活疫苗,则含有灭活的真病毒颗粒。蛋白疫苗,只含有一种或几种能刺激人体产生免疫力的病毒抗原蛋白,不含有真病毒颗粒。
腺病毒载体疫苗和mRNA疫苗,本质上是记录蛋白结构的图纸,而不是蛋白疫苗本身。所谓图纸,是指这两种疫苗含有编码病毒抗原蛋白的特定基因,后者会进到人体细胞内表达出病毒抗原蛋白(就像按图纸造楼房一样),进而刺激人体免疫系统。
把现役的病毒类疫苗,按技术路线整理成下面这张表,就一目了然了。
在蛋白疫苗里,如果不看COVID-19疫苗,一共有5种疫苗,VLP疫苗覆盖了其中的4种,如此高比例,难道只是巧合么?
让我们逐个VLP疫苗一探究竟吧。
一、乙肝疫苗
在讨论VLP疫苗的历史时,乙肝疫苗是当之无愧的全球首个VLP疫苗,然而当时并没有VLP这个概念,首个VLP疫苗的江湖地位,完全是后封的。
最初的乙肝疫苗于1982年上市,被称为血源乙肝疫苗,是从乙肝携带者的血液中提取灭活制成,其主要成分是乙肝表面抗原蛋白(HBsAg)组装成的球形颗粒,直径约22纳米。
这种来自血液的乙肝疫苗颗粒,和电镜中的乙肝病毒亚层结构非常相似,这是其预防效果良好的重要原因之一。由于伦理、产量和安全性等原因,1986年起基于基因工程的重组蛋白乙肝疫苗问世,很快就取代了血源乙肝疫苗。
乙肝疫苗,看起来就像乙肝病毒内的二十面体核心
基因工程乙肝疫苗,是把表达HBsAg的基因转入酵母菌或哺乳动物细胞,利用后者批量生产出HBsAg蛋白制成的,神奇的是: 这种HBsAg蛋白被生产出来后,会自动组装成正二十面体的VLP颗粒。
权威的疫苗学著作——普罗特金著《Vaccine》第6版,在介绍基因工程乙肝疫苗时,这样表述: 表达的HBsAg多肽自动装配成免疫原性球形颗粒,酷似慢性乙肝感染者血清中所发现的天然22纳米颗粒,这些疫苗颗粒与自然颗粒的区别只在于HBsAg的糖基化。这个表述中,并没有出现VLP病毒样颗粒的说法。
乙肝疫苗的生产企业,可能觉得乙肝疫苗历史悠久,保护效果已经足够让人满意,各家都是VLP疫苗,所以没有必要把VLP概念引入自家疫苗的说明书里以强调其技术优势。
博尔纳公司乙肝疫苗说明书,未见VLP或病毒样颗粒
笔者看过中国市场上所有的乙肝疫苗说明书,其【成分与性状】的描述大意均为: 本品由XX菌/细胞表达的HBsAg经纯化,加入铝佐剂后制成…… 无一出现出现“VLP”或“病毒样颗粒”的说法。
二、宫颈癌疫苗
全球第一个HPV疫苗(宫颈癌疫苗)——默沙东的4价疫苗,于2006年在美国上市。之后,史克的2价疫苗,默沙东的9价疫苗和厦门万泰的2价疫苗陆续上市。
从宫颈癌疫苗开始,VLP的概念被写入了疫苗说明书。 《Vaccine》第6版在介绍宫颈癌疫苗时,也明示: 目前商业化的预防HPV病毒的疫苗都是基于VLP的疫苗。
不过在面向公众和预防接种管理人员的宫颈癌预防宣传中,宫颈癌疫苗通常只是被宣传为基因工程的重组蛋白疫苗,极少被提及还是一种VLP疫苗。
宫颈癌4价疫苗中文版说明书里明示VLP
宫颈癌疫苗的VLP,成分和结构都值得研究。
首先,天然HPV病毒颗粒的外壳主要由两种结构蛋白构成——L1蛋白和L2蛋白。研究发现,单独的L1蛋白或是L1与L2蛋白一起,都能自动装配成VLP,其结构与天然HPV病毒颗粒几乎没有差别,具有良好的免疫效果。
单独的L2蛋白,倒是无法自动装配成VLP,但其与L1蛋白一起装配VLP,可以提高装配效率和提高结构的稳定性,可以理解为沙子和石块形成的混凝土更加牢靠。
不过,L1蛋白自动装配成的VLP已经足够好,所以现役的4种宫颈癌疫苗全都只用L1蛋白。
如果你以为一堆L1蛋白会像变形金刚那样,奇奇咔咔就自动装配成VLP,那你错了。首先要有5个L1蛋白聚合成一个五聚体,然后72个五聚体才自动装配成一个VLP,一个VLP包含360个L1蛋白。
还有一点很重要,用基因工程表达的L1蛋白直接装配出来的VLP,大大小小、形态各异,稳定性较差。所以,还需要对其进行纯化,先解聚得到单体L1蛋白,再重新组装成VLP。重装VLP整齐划一,更加紧凑、颗粒更大、表面凸起更显著,质量更稳定,免疫原性更佳。
下表是全球4种宫颈癌疫苗的上市情况、技术路线和L1蛋白含量。
上表中,每种宫颈癌疫苗的L1蛋白含量,均用重量单位μg(微克)来表示。然而,如果了解到宫颈癌疫苗是一种VLP疫苗,则应该意识到:仅用重量单位来评价L1蛋白,损失了其立体结构信息。
100微克一盘散沙的L1蛋白,和100微克形成VLP的L1蛋白,怎么可能是一回事呢!
如果A疫苗中100微克L1蛋白只有50%形成了VLP,B疫苗中100微克L1蛋白有90%以上都是VLP,虽然两者都是100微克,但B疫苗的免疫效果很可能优于A疫苗,这是显而易见的,只要承认VLP比散沙蛋白的免疫原性更强。
这在乙肝疫苗上,已经有所体现。
乙肝疫苗目前有三种重组技术载体:啤酒酵母、汉逊酵母和CHO细胞。有研究发现,同样10微克的乙肝疫苗,不同技术表现出来的免疫原性会略有差异。
同为酵母,汉逊酵母表达的HBsAg,其形成完整VLP的比例高于啤酒酵母。在一些人群研究(不是全部)中发现,接种同等剂量不同技术的乙肝疫苗,汉逊酵母乙肝疫苗的抗体水平或阳转率会更高些(并未发现保护率的差异)。
这就带来了VLP疫苗质量评价标准的问题。
VLP疫苗质量的优劣,除了比较重量,还要比较VLP的含量。这就需要验证VLP的完整性,同时对VLP进行计量,两者结合起来才是更好的质量指标。
也许,将来宫颈癌疫苗的L1蛋白指标会变成: XX微克(90%VLP)。其中的XX微克仍然是L1蛋白的重量,90%VLP则是结构完整VLP的百分比。
VLP疫苗是单体蛋白装配出来了,那么用不同的单体蛋白能否装配出一个混搭的VLP球呢?答案是肯定的。
混搭VLP示意图
目前,宫颈癌疫苗做到了9价,含有L1蛋白共270微克。相比4价疫苗,其针对最致癌的16型和18型HPV的L1蛋白,分别增加了50%和100%,这很可能是因为抗原蛋白多了会互相竞争/干扰,所以不得不加大剂量。如果基于现有VLP技术去做覆盖更多HPV型别的疫苗,在成本控制和安全性上的挑战很大。
2018年12月,厦门大学生命科学院研究团队在Nature Communication上发表了宫颈癌疫苗嵌合VLP的论文,这项技术有望突破传统VLP技术恐难覆盖更多HPV型别的瓶颈。
厦大团队先确定了20个高致病型别HPV病毒(导致了99%以上的宫颈癌和90%以上的尖锐湿疣),再根据其L1蛋白进化顺序上的远近关系,把20个型别HPV病毒分为7组(6个为三个型别一组,1个为两个型别一组),同一组里的多个型别L1蛋白利用环交换技术做成嵌合VLP。
基于上图种第1组三个型别HPV病毒,他们构建了HPV33-52-58嵌合型五聚体,再由72个嵌合五聚体构成正二十面体的VLP。在冷冻电镜下,第1组嵌合型VLP与单独HPV33型VLP进行比较,肉眼很难看出差异。
这个第1组嵌合型VLP,在小鼠和非人类灵长类动物中产生的中和抗体,与单独用这三个型别VLP产生的中和抗体滴度相当,能有效预防这三个型别病毒的感染。
用同样的方法,厦大团队又把进化树上第2、3、5和6组的嵌合VLP都构建出来了。经过小鼠验证,这4组嵌合VLP的中和抗体水平与各型别VLP混合的中和抗体水平相当。
厦大团队认为:经过改进,他们可以设计一种包含7组嵌合VLP、针对20个型别HPV病毒的宫颈癌疫苗,预防超过99%的宫颈癌和90%以上的尖锐湿疣。
三、戊肝疫苗
全球首个且目前唯一的戊肝疫苗(厦门万泰的益可宁),2011年在中国获批上市。2015年,世界卫生组织为戊肝疫苗颁布了立场文件。
益可宁利用大肠杆菌表达戊肝病毒表面的结构蛋白P329,也是一种基因工程重组蛋白疫苗。其VLP的形成分为三步:第一步,两个P329蛋白聚合为二聚体;第二步,5个二聚体聚合为十聚体;第三步,72个十聚体自动装配成正二十面体VLP。
戊肝疫苗益可宁的电镜照片
《Vaccine》第6版出版时,尚无戊肝疫苗上市,其介绍了三种正在研究中的戊肝疫苗,一种是 益可宁,另一种是史克公司和Novavax公司基于基因工程棒状病毒/昆虫细胞表达的产品,三者都是VLP疫苗。
不过, 益可宁说明书里并未像宫颈癌疫苗说明书那样明示VLP。只是表述为:基因工程大肠埃希菌表达的戊肝病毒结构蛋白经纯化,复性并加铝佐剂混合制成。
戊肝疫苗说明书 ,未见VLP或病毒样颗粒
笔者认为,戊肝疫苗晚于宫颈癌4价疫苗5年问世,生产企业应该知道VLP的概念,但可能不认为这是一种值得明示的技术(毕竟是自动装配的),所以没有在说明书里提及。
戊肝疫苗VLP和宫颈癌疫苗VLP的形成过程相比,除了步骤多了一步,其抗原蛋白也有所不同。
宫颈癌疫苗的VLP由HPV病毒的全长L1结构蛋白装配,戊肝疫苗的VLP由戊肝病毒结构蛋白(ORF2)基因截短表达的P329蛋白装配,可以让VLP更加稳定。有人也研究了截短宫颈癌疫苗的L1蛋白,发现适当截短确实可以让VLP更稳定,但截多了可影响VLP的装配。
四、流感疫苗
流感疫苗是目前技术路线最眼花缭乱的疫苗(没有之一),包括:有活疫苗、灭活疫苗、裂解疫苗、高剂量疫苗、新型佐剂疫苗、蛋白亚单位疫苗、重组蛋白疫苗等。
1997年,瑞士的Crucell/Berna公司上市了一种使用类病毒体(Virosomal)技术的蛋白亚单位流感疫苗Inflexal V。这个Virosomal和VLP,在对疫苗立体结构的描述上,没有实质性区别。
作为一种亚单位疫苗,Inflexal V的纯度高,且生产工艺不含甲醛和硫柳汞,可引起过敏的卵清蛋白含量在当时的流感疫苗里最低。 在健康和免疫功能低下的老年人、成人和儿童中均显示出良好的免疫原性。
Inflexal V有 两点不同于前面三种VLP疫苗:
其一,Inflexal V的原料,不是基因工程表达的重组蛋白,是鸡胚培养的流感病毒进行充分裂解、纯化后的亚单位蛋白——HA蛋白以及卵磷脂,两者都是非基因工程表达的;
其二,双层卵磷脂形成膜结构的VLP骨架,HA蛋白插入卵磷脂膜形成VLP,这种VLP不是正二十面体,但看上去更像流感病毒。
流感病毒(左),Inflexal V的VLP(右)
Inflexal V的中文名为【因福舒】,2006年曾进入中国市场,2010年起无销售。其包装的英文名称中有“Virosomal”字样,翻译成中文变成了毫无关系的“亚单位”,没能体现类病毒体这个技术特点,无法与普通的亚单位疫苗区分开。
VLP的字面意思是病毒样颗粒,但人们在讨论VLP疫苗时往往默认VLP疫苗都是基因工程重组蛋白疫苗。 Inflexal V提醒我们,从字面定义来看,类病毒体疫苗妥妥地也是VLP疫苗。不过,随着疫苗技术的发展,将来的VLP疫苗应该是 基因工程重组蛋白疫苗的天下。
Crucell/Berna公司还将其流感病毒类病毒体(IRIV)技术用于其甲肝灭活疫苗Exapal,还比 Inflexal V早一年(2005年)在中国上市,中文商品名:爱巴苏。爱巴苏应该是中国首个类病毒体/VLP疫苗。
Exapal的中文包装盒上没有提到 “Virosomal”或“ 类病毒体”,只是在说明书的【作用与用途】里这样描述道(大意): IRIV是 Berna公司开发的一项免疫增强技术,用流感病毒血凝素吸附在卵磷脂脂质体双层面上构建IRIV,这些携带了灭活甲肝病毒的 IRIV可以与免疫细胞上的受体主动结合,激发免疫应答。
甲肝病毒颗粒的直径为27纳米,前述 三种经典VLP疫苗的颗粒直径在20~30纳米,如 果IRIV与这些VLP的颗粒直径在同一尺度上,似乎很难说成功携带灭活的甲肝病毒。
实际上, IRIV颗粒直径为150纳米,而流感病毒的直径是80~120纳米,所以 IRIV看上去就是一个大号的流感病毒。 IRIV的直径是甲肝病毒颗粒直径的5.6倍,相当于足球与乒乓球,那么足球表面粘多个乒乓球还是可以想象的, Exapal的电镜照片和模拟图确实如此。
关于VLP的表达系统:
绝大多数VLP疫苗是基因工程重组蛋白疫苗,用于表达VLP结构蛋白的表达系统分为真核表达系统和原核表达系统,前者包括哺乳动物细胞、酵母细胞、杆状病毒/昆虫细胞、植物细胞,后者主要有大肠杆菌。目前已报导的VLP疫苗约70%基于真核表达系统,30%基于原核表达系统。
各种表达系统都有各自的优缺点, 哺乳动物细胞表达病毒蛋白最逼真、但产量低,稳定性不足;酵母细胞应用广泛,产量大,可以表达嵌合VLP,逼真度不如哺乳动物细胞,蛋白糖基化不足; 杆状病毒/昆虫细胞在逼真度、产量方面都有优势,但需要注意杆状病毒和VLP颗粒接近,分离纯化难度大;大肠杆菌的优缺点与酵母细胞类似。
VLP的包膜与层数:
病毒分为有包膜病毒和无包膜病毒两大类,前者结构复杂,构建VLP的难度大,但可设计性也更强。一般认为,无包膜VLP可以由原核表达系统和低级真核表达系统实现,有包膜VLP只能在真核表达系统,还需要宿主膜嵌入技术支持,挑战很大。
戊肝病毒和HPV病毒为无包膜病毒,其VLP疫苗为无包膜VLP。乙肝病毒和流感病毒是有包膜病毒,但乙肝疫苗为无包膜VLP疫苗,流感VLP疫苗则是另类VLP。这可能意味着,对于有包膜病毒并非必须构建有包膜VLP,但如果能实现有包膜VLP,可能效果会更好。
另外,VLP可以实现双层,甚至三层,可以插入不同的病毒蛋白,实现多价疫苗或者多联疫苗的效果。
正在开发中的人用VLP疫苗包括:
手足口疫苗(EV71病毒)、手足口2价疫苗(EV71病毒+CA16病毒)、呼吸道合胞病毒疫苗、诺如病毒疫苗、埃博拉疫苗、流感疫苗、基孔肯雅病毒疫苗、艾滋病疫苗、疟疾疫苗、COVID-19疫苗等。
上述COVID-19疫苗,是指Novavax的创新佐剂重组S蛋白纳米颗粒疫苗(商品名:Nuvaxovid),已经完成了Ⅲ期临床试验,其效果和安全性与两款获批的mRNA疫苗相当。其VLP结构不是病毒蛋白自动装配的正二十面体,而是由附着在纳米颗粒上的重组蛋白聚集而成,不能否认这也是一种VLP。
Nuvaxovid成品示意图
中国则在2021年批准紧急使用了全球第一款COVID-19重组蛋白疫苗(商品名:智克威得),其基于RBD蛋白,使用传统氢氧化铝佐剂。 智克威得的RBD蛋白为二聚体结构,没有自动装配成VLP,不算VLP疫苗。 但是,其免疫效果超过了腺病毒载体疫苗和灭活疫苗。
正在开发中的动物VLP疫苗包括:
口蹄疫疫苗、小反刍兽疫疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪圆环病毒疫苗(Ⅱ型)、猪细小病毒疫苗、高致病性禽流感疫苗、新城疫疫苗、裂谷热疫苗、蓝舌病毒疫苗等。
总结:
各种VLP疫苗的基本原理相似,即对病原体进行研究,找到免疫原性好且能自动装配成VLP的抗原蛋白,通过合适的表达系统和工艺,制备成VLP疫苗。
正在开发的人用VLP疫苗,有很多有现役疫苗,是因为基于基因工程重组蛋白构建VLP,可以完全人工设计、能对VLP进行多种修饰满足不同需求,其免疫原性和安全性的可控程度高,正在成为疫苗研发的热点方向。
(完)
参考文献:
https://doi.org/10.1016/S0163-7827(99)00017-X
DOI: 10.1186/s12951-021-00806-7
DOI: 10.1016/j.vaccine.2009.05.029
DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2019.04.011
DOI:10.3969/j.issn.1008-0589.201712009
DOI:10.3760/cma.j.cn112309-20191125-00394
DOI :10.13309/j .cnki .pmi .2001.03.013
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